肺泡灌洗和痰涂片、mNGS結(jié)果均為曲霉菌,痰和肺泡灌洗培養(yǎng)出來的卻是根霉菌,哪個(gè)環(huán)節(jié)出了問題?血mNGS結(jié)果為貓立克次體,序列總數(shù)53152條,而肺泡灌洗卻只有5條支原體?二代測(cè)序結(jié)果為陰道加德納菌,肺泡灌洗測(cè)出70多種細(xì)菌,是操作不當(dāng)還是病人存在嚴(yán)重的衛(wèi)生問題?
以上實(shí)例都是臨床使用mNGS時(shí)出現(xiàn)的問題,浙大一院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科的周華醫(yī)生在中青年呼吸學(xué)者論壇上進(jìn)行了分享,那么,mNGS對(duì)病原學(xué)的診斷與傳統(tǒng)方法相比有什么優(yōu)勢(shì)?mNGS出現(xiàn)假陰性或假陽性時(shí),我們?cè)撛趺崔k?為何反復(fù)強(qiáng)調(diào)小心驗(yàn)證的重要性?
感染性疾病診斷的核心難題是「病原診斷」
在開發(fā)出NGS技術(shù)之前,即使用遍所有的方法去診斷感染性疾病,還是會(huì)面臨很多困難,也就是說很多感染性疾病的病人無法及時(shí)精準(zhǔn)診斷病原體,導(dǎo)致治療延誤或者治療不當(dāng),增加致死率,加重醫(yī)療花費(fèi)。現(xiàn)在應(yīng)用mNGS技術(shù)之后,很多病人還是無法明確病原體,因此我們需要探索新的方法。
目前病原微生物鑒定的檢測(cè)技術(shù)有哪些?
病原學(xué)檢測(cè)方法包括培養(yǎng)和非培養(yǎng)的方法。其中非培養(yǎng)方法包括直接涂片法,多用于細(xì)菌、真菌、 分枝桿菌檢測(cè);還有抗原/抗體檢測(cè),很早以前核酸檢測(cè)就應(yīng)用于臨床,以前基于PCR技術(shù)或者多重PCR技術(shù)來做病原體檢測(cè),隨著二代測(cè)序價(jià)格下降,二代測(cè)序就被用于臨床做感染病人的病原學(xué)診斷。
mNGS對(duì)病原學(xué)診斷與傳統(tǒng)方法相比,具有什么優(yōu)勢(shì)
mNGS指宏基因組二代測(cè)序(Metagenomic Next-generation Sequencing),臨床也稱之為二代測(cè)序、宏基因組測(cè)序、高通量測(cè)序。
宏基因組測(cè)序(Metagenomic Sequencing)對(duì)病原學(xué)診斷與常規(guī)的培養(yǎng)相比具有理論優(yōu)勢(shì)。
優(yōu)勢(shì)是沒有偏移性,比如一個(gè)標(biāo)本中既有曲霉菌又有白色念珠菌,培養(yǎng)時(shí),如果白色念珠菌生長(zhǎng)較快,便會(huì)影響曲霉菌的生長(zhǎng),假如一口痰中既有白色念珠菌又有奴卡菌,白色念珠菌生長(zhǎng)有優(yōu)勢(shì)可能影響了奴卡菌的陽性率。所以培養(yǎng)是有偏移性的,但理論上說,宏基因組測(cè)序?qū)Σ≡瓕W(xué)診斷沒有偏移性。
優(yōu)勢(shì)是廣覆蓋,對(duì)于常規(guī)的感染性疾病的診斷來說,我們根據(jù)臨床思維,判斷高危因素和病原體,選擇必要的檢測(cè)手段,如果評(píng)估不全面可能導(dǎo)致漏檢。理論上,宏基因組測(cè)序可以沒有偏移的把標(biāo)本中所有病原體的核酸都檢測(cè)出來,所以覆蓋面更廣。
優(yōu)勢(shì)是高效率,可以同時(shí)檢測(cè)多種病原體。
mNGS診斷方法的優(yōu)勢(shì):「一網(wǎng)打盡」
類比一下,傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測(cè)方法如同釣魚一樣,需要加上誘餌(引物或抗原抗體),一次只釣一種魚,或者使用多重PCR的方法,放幾個(gè)魚鉤一起釣,一次性釣幾種。而病原宏基因組學(xué)方法學(xué)就如同撒一張大網(wǎng)去全面覆蓋各種病原菌,將可能致病的病原菌一網(wǎng)打盡。
二代測(cè)序除了用于病原學(xué)診斷,還有哪些用途?
二代測(cè)序不僅可以用于病原學(xué)檢測(cè),也可以在病原培養(yǎng)后做深度的二代測(cè)序,甚至全基因組分析?,F(xiàn)在主要用于臨床的還是臨床標(biāo)本病原學(xué)檢測(cè),通過檢測(cè)可以知道標(biāo)本中含有的病原體。如果測(cè)序量能夠進(jìn)一步突破,它除了可以把標(biāo)本中里所有微生物的核酸測(cè)出來外,也可以把人體表達(dá)的所有RNA測(cè)出來,幫助判斷定植或者感染。比如銅綠假單胞菌測(cè)出來后,人體有沒有針對(duì)它產(chǎn)生炎癥反應(yīng),還可以判斷是定植還是感染,但目前還在探索階段,尚常規(guī)未用于臨床。
mNGS檢測(cè)有幾步?
目前對(duì)于二代測(cè)序來說,給它一個(gè)臨床標(biāo)本,不經(jīng)過培養(yǎng)的話,還是只能用于病原學(xué)診斷。使用二代測(cè)序來做病原學(xué)診斷有六個(gè)基本步驟,一個(gè)是采集感染部位樣本,后一步是報(bào)告解讀,中間有四個(gè)步驟分別為提取核酸、高通量測(cè)序、生物信息分析、檢測(cè)結(jié)果報(bào)告,這四步都不由臨床醫(yī)生操作,由實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員操作完成。其實(shí)我們臨床醫(yī)生要做好一步和后一步,也要了解中間的四步,在報(bào)告解讀的時(shí)候需要了解其中的技術(shù)問題,這樣才能讀懂報(bào)告。